烟草在线据云南烟叶信息网报道　　近日发表在《烟草科技》2016年第6期上的“基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析”研究揭示，NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成中起重要作用，NtDXR基因敲除后发现有碱基插入、缺失与置换，部分T0代转基因阳性植株呈现白化表型，推测NtDXR基因突变能阻断烟草质体色素合成。

　　5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（DXR）是2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）生物合成途径中的第一个限速酶，能催化5-　磷酸脱氧木酮糖（DXP）生成MEP。由MEP途径合成的西柏烷类化合物、类胡萝卜素类化合物和岩蔷薇类化合物是烟叶重要的致香前体物质，DXR基因表达的强弱会影响烟叶中单萜、双萜以及四萜类物质的重新分配，影响烟叶品质。

　　该研究从普通烟草品种红花大金元中克隆获得NtDXR基因，采用荧光定量PCR技术分析NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式，同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体，获得了DXR基因突变的植株。结果表明，NtDXR基因在花中高表达，在雌蕊和叶中次之；利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后，检测目的基因靶位点序列发现有碱基插入、缺失与置换，并且部分T0代转基因阳性植株呈现白化表型，暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用，推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。

　　CRISPR/Cas9系统是近年发展迅速的一种基因组编辑技术，该技术利用向导RNA（guide RNA）与基因的靶序列结合，在Cas9核酸内切酶的作用下对靶DNA进行切割，基因组断裂后启动DNA修复系统，修复过程中可能有碱基的插入、缺失和置换，从而引起蛋白翻译发生错误，导致基因功能丧失。该研究明确了NtDXR基因在烟草萜类化合物代谢中的作用，为选育烟草优良品种提供理论基础。

左图为转基因阳性组培苗，右图为呈白化表型的转基因植株

图1　转基因植株T0代表型

M. Trans2K DNA Marker 1-6. pORE-Cas9/gRNA-NtD transgenic plants

　　XR载体菌液PCR产物。a.敲除载体PCR电泳图　b.敲除载体测序结果分析（红色碱基为靶位点序列）　c.敲除载体示意图

图2　敲除载体检测及结构示意图

图3　转基因烟株内源NtDXR　基因序列分析（蓝色碱基为靶位点，红色碱基为突变位点）