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转基因烟草的控制与检测

2004年01月05日 来源:中国烟草进出口烟叶检测站 作者:郭兆奎
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  1 转基因烟草的研究现状   自本世纪八十年代以来,基因工程技术取得突破性的进展。通过生物遗传信息的人为操作进行转移,使植物、动物和微生物的生物特性发生改变,出现原物种不具有的性状或产物,产生有利于人类的产量高、营养丰富、抗病能力强等优势的品种。据有关资料统计,从1996-2000年,全球种植转基因作物的面积增长了25倍之多,平均每年以1000多万公顷的速度递增。仅2000年,美国种植转基因作物的面积就达3030万公顷,占全世界转基因作物面积的68%;其中阿根廷1000万公顷,占23%;加拿大300万公顷,占7%;中国50万公顷,占1%;南非和澳大利亚也都分别超过了10万公顷。转基因植物已在至少12个国家进行了商业化种植,种植面积已达2900万公倾,约占世界总种植面积的3%。   烟草是一种模式植物, 其组织培养、转基因分子操作等各项技术已非常成熟,国内外已将多种非烟草来源基因转入烟草,烟草上国外进行了抗除草剂、抗病毒(包括抗烟草普通花叶病、烟草黄瓜花叶病、烟草马铃薯Y病毒的外壳蛋白和病毒复制酶基因和来源于黄瓜花叶病毒的微卫星RNA)、抗真菌病害(几丁质酶基因)和抗虫基因(胰凝乳蛋白基因、BT基因),国内主要进行了抗病毒(包括抗烟草普通花叶病、烟草黄瓜花叶病、烟草马铃薯Y病毒的外壳蛋白和病毒复制酶基因)和抗虫基因(BT基因)等方面的转基因工作   2 基因制品的安全性研究   随着转基因技术的日趋成熟,转基因作物由实验室走向大田试验,不少作物已商品化生产,人们越来越关注转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、转基因产品作为食品对人类健康的影响等问题。   2.1 转基因作物演化为杂草的可能性   能和近缘野生杂草杂交的转基因作物,可以使包括抗除草剂在内的抗性基因从转基因作物漂流到杂草上,使杂草对某种除草剂产生抗性而难以控制,从转基因植株流向杂草的其他抗性基因,也可能给杂草种群带来生物学优势,形成超级杂草,研究结果表明:从高粱到假高梁、从水稻到红稻、从燕麦到野燕麦、从芥菜型油菜到野油菜的基因漂移概率为100%,而从甘蓝型油菜到野油菜的概率则较小。   2.2 抗虫转基因作物带来的潜在风险   1994年Tabashnik等报道有些转基因作物商业释放前,在田间实验和实验室中已经观察到某些昆虫产生一定水平的BT抗性,但目前在大量商业化种植的生产田中还未发现对Bt杀虫蛋白产生强抗性的害虫类型。   2.3 转Bt基因作物对昆虫群落的影响   Dale(1994)报道Bt转基因马铃薯地块中的节肢动物生物多样性低于非转基因马铃薯地块。Hilbeck(1998)用取食转基因Bt玉米的欧洲钻心虫饲喂草铃虫,草铃虫死亡率在60%以上,而取食非转基因玉米的欧洲钻心虫为饲料的草铃虫死亡率在40%以下。   2.4 抗病毒转基因作物带来的潜在风险   来源于某种病毒的基因转到植物上是否有可能与侵染该植物的病毒基因发生重组而形成新的病毒,或使病毒的侵染力和侵染范围增大,Chen和Franki(1990)报道黄瓜花叶病毒的外壳蛋白包装烟草花叶病毒基因组,结果原先不能被昆虫传播的TMV可以被昆虫传播,引起烟草普通花叶病。Farinelli等(1992)报道,含一种马铃薯Y病毒的外壳蛋白基因的转基因烟草,被另一种马铃薯Y病毒感染后,转基因烟草上出现了两种病毒类型:除正常的感染病毒外,还有一种是由转基因烟草合成的外壳蛋白包装的病毒。以上两个试验结果表明RNA的重组有可能引起新病毒的产生。   Schoelz和wintermantel(1993)曾报道转基因植物中的花椰菜花叶病毒(CaMV)基因从转基因植物基因组中获得了某一段核苷酸顺序,与外源的花椰菜花叶病毒重组后产生了一种改变了寄主范围的新的CaMV,这种病毒不仅可以侵染原先的寄主类型,而且可以侵染其它寄主类型,扩大了寄主范围。   2.5 转基因作物在毒理学方面产生的潜在风险   2.5.1 转入DNA分子本身带来的影响   一般认为人类消化道每天都会有大量的DNA经过,绝大多数DNA在消化道内都被降解了,自然也就失去基因的活性,有研究认为微生物获得外源DNA并与自身DNA重组这一系列过程的发生,需要有一定条件(如ph、辅助离子等)而这些条件在消化道环境下是不具备的,自然也就不会发生DNA重组、引发微生物抗药性增加等危险。也有研究认为GMO可能把DNA片断如卡那霉素抗性基因等抗生素抗性基因,传给我们体内存在的细菌,从而增加细菌对抗生素的抗性,使抗生素失效,2002年6月,各国媒体都报道英国纽卡斯尔大学的研究人员发现转基因食品中的臧DNA片段可以进入人体肠道中的细菌体内,英国的研究显示,转基因作物中的突变基因可能会进入到生物的有机体,科学家认为突变基因如跨越种群和转移至细菌,其结果可能会导致新的疾病。   所有上述安全性问题至今还未取得足够的证据证实有或无,及其严重程度。致使转基因制品在市场流通也有很多限制,大多数消费者不接受转基因产品,对其持反感态度,随着转基因作物获准上市种类的增多和规模扩大,欧盟各国特别组,德国、瑞士和奥地利等国相继出台了大豆、玉米及其产品的管理办法,欧洲各国的标签法要求上市蔬菜、食品和农产品等必须标明是否属转基因产品。   3 我国烟草行业为控制转基因烟草种植采取的控制措施   3.1 颁布转基因制品管理条例   我国对基因改良及其产品的安全性管理非常重视,相继出台了有关管理条例和管理办法,1993年12月24日国家科学技术委员会发布《基因工程安全管理办法》,1996年7月10日中华人民共和国农业部第7号令发布《农业生物工程安全管理实施办法》,2001年5月23日国务院颁布《农业转基因生物安全管理条例》、为配合该条标识管理、保护人类健康和动植物、微生物安全,保护生态环境,保护消费者的知情权和选择权,2002年1月15日农业部同时发布3个管理办法《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和农业转基因生物标识管理办法》,规定从2002年3月20日起含有转基因成分的大豆、番茄、棉花、玉米、油菜5种作物及其产品如大豆油)需标明转基因成分才能加工和销售。1998年3月25日国家烟草专卖局发布《烟草基因工程研究及其应用管理办法》,通过国家烟草专卖局烟草基因工程管理委员会对烟草基因工程研究和田间试验进行规范化管理,要求相关工作前履行严格的申报手续。   3.2 建立烟草种子繁育、供应体系,加强种子规范化管理   在中国烟叶生产购销公司的直接管理下,1999年在全国各烟区建立了烟草良种繁育基地,根据区域划分,负责本区域内的烟草良种的生产、供应和管理,并由各级烟草公司通过集约化育苗、合同种植、规范田间管理杜绝烟农自留种和非正规渠道烟草种子,有效地控制了烟草转基因问题。   3.3 建立烟草种子、烟田和烟叶成品的转基因监控体系   在国家烟草专卖局烟草基因工程管理委员会指导下,在严格规范烟草基因工程研究的同时,加大力度在全国各产烟市县通过对烟叶生产、加工备货过程中的三个重要环节(烟草种子、鲜叶和烤后烟叶)进行取样检测,杜绝转基因烟草种子流入大田生产,保证了我国烟叶贸易不受转基因问题的影响。   3.4 参加CORESTA转基因烟草检测共同试验   1998年10月中国烟草总公司选派技术人员参加了CORESTA(国际烟草科研与合作中心)转基因烟草检测方法项目组,参与编写了CORESTA烟草转基因检测方法,并与2001年11月和2002年3月参加了由18个实验室参加的烟草转基因定性检测共同试验,中国烟草进出口烟叶检测站取得了两轮定性检测准确率均达到100%,2003年3月和5月在两轮定量检测中也取得较为理想的检测结果,特别是在2003年5月第2轮实时定量PCR检测共同试验中取得了检测结果评分分值最高的好成绩,说明我们的检测水平已经走向列国际先进水平。   4 转基因烟草检测方法   转基因烟草的检测可通过分析其引入的DNA序列进行,通常是选择转基因烟草所共有而非转基因的正常烟草和相关的微生物中都没有的一段或几段核苷酸序列作为检测标记,依据检测标记的序列合成PCR引物,利用TaqDNA聚合酶将从烟草材料中提取的DNA进行扩增,使目标序列达到可检测的水平,目前通用的靶序列包括35S启动子、nos启动子、nos终止子和NPTII基因。   4.1 定性检测方法   首先同时进行两种或两种转基因烟草通用标记(花叶菜花叶病毒35S启动子和根癌浓杆菌nos终止子)的PCR扩增,对未出现PCR特异性条带的样品分别进行35S和NOS巢式PCR反应以提高检测灵敏度,若PCR扩增仍为阴性,该样品可定为阴性,对于出现35S或NOS扩增出现PCR特异条带的样品需重新提取DNA,再次进行共有引物的PCR检测,并通过巢式PCR、限制性内切酶酶切、目的基因PCR扩增和探针杂交进行结果验证,以确定所转目的基因的种类并排除由于非特异性扩增和污染造成假阳性结果。   4.2 实时荧光定量PCR检测方法   实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,荧光PCR不同于其他PCR在于PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化,荧光信号变量与扩增产物变量成正比,并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,还具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。   根据荧光染料所存在的形式不同,荧光定量PCR可分为两种:   1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,荧光标记探针的

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